細(xì)菌分離鑒定

　　大多數(shù)細(xì)菌均可以通過人工方法培養(yǎng)，只有將微生物培養(yǎng)出來才能對它進(jìn)行研究、鑒定和應(yīng)用。下面是小編幫大家整理的細(xì)菌分離鑒定，僅供參考，歡迎大家閱讀。

　　目的要求：

　　熟悉臨床標(biāo)本中常見的病原性細(xì)菌的分離鑒定方法。

　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

　　一、膿汁、咽拭子等標(biāo)本中病原性細(xì)菌的分離與鑒定

　　(一)標(biāo)本采集

　　1.膿拭子：用無菌棉簽蘸取患處深部膿液或分泌物少許，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。

　　2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用無菌棉簽挑取膿稠痰塊，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。

　　3.咽拭子：囑病人把口張大，用壓舌板壓住舌根，用無菌棉簽迅速蘸取咽部分泌物，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。

　　4.血標(biāo)本：疑為敗血癥患者，在嚴(yán)格無菌操作下，靜脈采血，床旁直接加入含50ml的肉湯瓶內(nèi)，立即搖勻后送培養(yǎng)。

　　5.腦脊液：對疑似流腦患者，作腰椎穿刺取腦脊液，立即行直接床旁接種(送檢過程中應(yīng)注意保溫)。

　　6.尿道、陰道分泌物：對可疑淋病患者，男性可從尿道取材，取材時導(dǎo)尿管應(yīng)進(jìn)入尿道1cm～2cm，如為剛排尿，應(yīng)等待1h左右;女性則可以從宮頸口取分泌物，當(dāng)內(nèi)窺器插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻，再旋轉(zhuǎn)取出，取材應(yīng)立即送檢，不可放置冰箱。

　　(二)分離鑒定程序

　　待檢標(biāo)本可直接做涂片染色檢查鑒定，必要時可做分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)及致病性鑒定。常見的致病性球菌檢查程序如下。

　　直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態(tài)、排列、染色性)

　　膿、痰、咽拭子

　　分泌物、腦脊液 觀察菌落性狀、溶血性、色素

　　血瓊脂平板→ 涂片、染色、鏡檢

　　↑ 挑取可疑菌落 生化反應(yīng)

　　血液、穿刺液 →肉湯培養(yǎng)基 純分離 致病性測定

　　↓ 藥敏試驗(yàn)

　　如培養(yǎng)液混濁時可涂片、染色、鏡檢

　　(三)常見臨床標(biāo)本的檢查方法

　　1．膿拭子

　　在膿汁中除了球菌外，也有桿菌存在，例如革蘭陽性的有炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌、枯草桿菌等，革蘭陰性的有大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等，此外尚可有真菌、放線菌、螺旋體等。

　　材料

　　(1) 標(biāo)本：膿拭子

　　(2) 培養(yǎng)基：血瓊脂平板

　　(3) 兔血漿、白色濾紙片、無菌生理鹽水、載玻片

　　方法 膿汁 → 革蘭染色 → 鏡檢

　　↓ ↑

　　血瓊脂平板 →觀察菌落形態(tài)及溶血情況

　　↓

　　致病力試驗(yàn)

　　(1)將膿拭子作革蘭染色，鏡檢(先作培養(yǎng)再涂片以免污染)。標(biāo)本放置4℃冰箱保存，待報告發(fā)出后再丟棄。

　　(2)將膿汁涂布于血瓊脂平板上，再以滅菌接種環(huán)作劃線分離。置培養(yǎng)37℃培養(yǎng)18h～24h。

　　(3)經(jīng)培養(yǎng)后據(jù)菌落特點(diǎn)及涂片檢查結(jié)果進(jìn)行初步識別，根據(jù)需要再作進(jìn)一步鑒定。若菌落較大、溶血透明、產(chǎn)生金黃色色素、涂片為革蘭陽性球菌并成堆排列時可能系葡萄球菌，應(yīng)確定其為何種葡萄球菌;必要時再作血漿凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)，確定其致病力。

　　2.咽拭子

　　咽喉中存在的細(xì)菌較多，可以有厭氧及需氧性鏈球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四聯(lián)球菌、腦膜炎球菌、卡他球菌、喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌枯草桿菌、百日咳桿菌肺炎桿菌及綠膿桿菌等。此外也可有白色念珠菌奮森螺旋體等。本實(shí)驗(yàn)以咽拭子作為標(biāo)本，重點(diǎn)檢查病原性球菌。

　　材料

　　(1)標(biāo)本:咽拭子。

　　(2)培養(yǎng)基:血瓊脂平板。

　　方法

　　咽拭子

　　↓

　　血瓊脂平板

　　↓

　　觀察菌落形態(tài)及溶血性

　　↓

　　革蘭染色，鏡檢

　　取標(biāo)本涂布于血瓊脂平板，再以滅菌接種環(huán)劃線分離，置37℃培養(yǎng)18h～24h培養(yǎng)。標(biāo)本放置4℃冰箱保存，待報告發(fā)出后再丟棄。

　　可根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行鑒別：

　　(1)在菌落周圍產(chǎn)生2mm～4mm寬、界線分明、完全透明的溶血環(huán)、涂片為革蘭陽性球菌并呈鏈狀排列，可能是乙型溶血性鏈球菌。

　　(2)菌落細(xì)孝半透明、有草綠色溶血環(huán)、涂片為革蘭陽性球菌呈鏈狀排列，可能為甲型溶血性鏈球菌。需要進(jìn)一步與肺炎球菌區(qū)別時，可做膽汁溶菌試驗(yàn)及菊糖發(fā)酵反應(yīng)。

　　菌落細(xì)小半透明、不溶血、涂片為革蘭陽性鏈狀排列的球菌時，為丙型鏈球菌。

　　(4)菌落扁平邊緣隆起、中央稍凹、半透明、呈草綠色溶血、革蘭染色為陽性雙球菌、呈矛頭狀排列時為肺炎球菌，應(yīng)以膽汁溶菌及菊糖發(fā)酵反應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌區(qū)分。

　　(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革蘭染色為陰性雙球菌，呈腎形排列時，可能為腦膜炎球菌，需要進(jìn)一步作氧化酶試驗(yàn)及糖發(fā)酵試驗(yàn)(接種于含血清之葡、麥、蔗糖發(fā)酵管中)。

　　二、糞便標(biāo)本中腸道桿菌的分離與鑒定

　　(一)標(biāo)本收集

　　取患者的糞便或肛-門拭子。

　　(二)鑒定程序

　　腸道桿菌為一大群革蘭陰性桿菌，從形態(tài)及染色性上無法鑒別為何種菌，只能依靠生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行鑒定。

　　患者糞便(粘液、膿血)→腸道選擇、鑒別培養(yǎng)基(如ss、中國藍(lán)、伊紅美蘭)

　　↓

　　挑取可疑菌落(據(jù)大孝顏色、透明度而定)

　　↓

　　雙糖鐵及其他鑒別培養(yǎng)基

　　↓

　　據(jù)結(jié)果分析鑒定

　　↓

　　玻片凝集(做出特異性診斷)

　　葡萄糖乳糖動力H2S尿素

　　⊕⊕±--艾希菌屬非致病菌

　　⊕+---克雷伯菌屬

　　⊕±+++變形桿菌

　　⊕-++-乙型副傷寒致病菌

　　⊕-+±-甲型副傷寒

　　+-++-傷寒桿菌

　　+----痢疾桿菌

　　拓展：細(xì)菌的接種與分離技術(shù)方法有哪些？

　　（一）平板劃線分離法

　　在被檢標(biāo)本中，常混雜有多種細(xì)菌，平板劃線分離法可使這多種細(xì)菌在培養(yǎng)基表面分散生長，各自形成菌落，以便根據(jù)菌落的形態(tài)及特征，挑選單個菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。常用的平板劃線分離法有以下兩種：

　　1.連續(xù)劃線分離法　此法主要用于雜菌不多的標(biāo)本。用接種環(huán)取標(biāo)本少許，于平板1/5處密集涂布，然后來回作曲線連續(xù)劃線接種，線與線間有一定距離，劃滿平板為止。

　　2.分區(qū)劃線分離法　本法適用于雜菌量較多的標(biāo)本。先將標(biāo)本均勻涂布于平板表面邊緣一小區(qū)（第一區(qū)）內(nèi)，約占平板1/5面積，再在二、三、……區(qū)依次連續(xù)劃線。每劃完一個區(qū)，均將接種環(huán)滅菌一次。每一區(qū)的劃線均接觸上一區(qū)的接種線2～3次，使菌量逐漸減少，以獲得單個菌落。

　　（二）斜面接種法

　　該法主要用于單個菌落的純培養(yǎng)、保存菌種或觀察細(xì)菌的某些特性。用滅菌的接種環(huán)取單個菌落或少許細(xì)菌，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端。

　　（三）液體接種法

　　多用于一些液體生化試驗(yàn)管的接種。用滅菌接種環(huán)取菌少許，在試管內(nèi)壁與液面交接處的管壁上輕輕研磨，使細(xì)菌混合于培養(yǎng)液中。

　�。ㄋ模┐┐探臃N法

　　此法主要用于半固體培養(yǎng)基、明膠及雙糖管的接種。用接種針取細(xì)菌少許，從半固體培養(yǎng)基中央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接觸管底，然后接種針沿原路退出。

　�。ㄎ澹﹥A注平板法

　　測定牛乳、飲水和尿液等標(biāo)本細(xì)菌數(shù)時常用此方法。將標(biāo)本經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi)，傾入已溶化并冷卻至45℃左右的定量培養(yǎng)基，混勻，待凝固后倒置、培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)的菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)，即可計算出標(biāo)本的細(xì)菌數(shù)。

　　（六）涂布接種法

　　常用于紙片法藥物敏感性測定，也可用于被檢標(biāo)本中的細(xì)菌計數(shù)。加定量的被檢菌液于瓊脂平板表面，然后用滅菌的L型玻璃棒反復(fù)涂布幾次，使被檢物均勻分布在瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片培養(yǎng)，或直接培養(yǎng)觀察結(jié)果。

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