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多聯(lián)吡啶螯合物反相高效液相色譜法分離測定銅(Ⅱ)、鈷(Ⅱ)、汞(Ⅱ)
螯合物的穩(wěn)定常數都非常高,許多螯合反應都是定量進行的,可以用來滴定。使用螯合物還可以掩蔽金屬離子。下面是小編收集整理的多聯(lián)吡啶螯合物反相高效液相色譜法分離測定銅(Ⅱ)、鈷(Ⅱ)、汞(Ⅱ)，歡迎閱讀與收藏。
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親和色譜中使用的基體材料可分為天然有機高聚物、合成有機聚合物和無機載體材料三類。此外基體在偶聯(lián)間隔臂之前還需進行活化預處理。
作為親和色譜的基體材料應具備以下條件：
�、倬哂幸欢ǖ膭傂�、撓性和機械強度；
②具有在一定,5值范圍的化學穩(wěn)定性，不溶于普通試劑；
�、郾砻婢哂幸欢ǖ幕钚怨倌軋F，如羥基、胺基、醚基等，可被適當的試劑活化。
當使用基體材料時，還應了解它們的基本物理性質，如粒度、表面積、相對密度、孔徑和孔容等必要的參數。
1.基體的分類
�。�1）天然有機高聚物
親和色譜早期使用的基體材料主要是由天然有機高聚物制成的軟質凝膠，具有三維晶格結構或多孔網絡結構，凝膠內未被骨架占據的空間含有截留的液體，使其保持柔軟。凝膠顆粒呈均勻的球形，具有一定的機械強度，并具有化學惰性，常用的凝膠材料為：
�、倨暇厶牵―extran）它是由葡萄糖分子以α-1,6鍵相連、具有空間網狀結構的聚合物，分子量大于)+。市售SephadexG(Pharmacia，瑞典），是由精制葡萄糖與交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)共聚制得的球狀聚合物。0值表示不同的交聯(lián)度，G值愈大，孔徑愈大，G后邊的數字還表示每克干膠膨脹時吸水量的10倍，如0—56表示每克干膠可吸附水2.5g。SephadexG型的物理性質和應用范圍見表6-2-2，其中,SephadexG-200是理想的適用于分離細胞組織的親和色譜基體。SephadexG可耐受110℃高溫和0.5mol/LNaOH溶液處理，其骨架上眾多的羥基可以活化用于偶聯(lián)其他化合物。
葡聚糖①和Sephadex②的化學結構如下：
�、侪傊牵ˋgarose）它是由D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖交替連接的鏈狀多糖，糖鏈間通過氫鍵形成穩(wěn)定的多糖螺旋束網狀結構，其化學結構如下：
瓊脂糖凝膠是親水、疏松的，分子量超過78+的生物大分子可自由進出凝膠顆粒。它具有良好的化學惰性，可在0-40℃和pH=4-9的條件下使用，不發(fā)生離子交換，對生物大分子僅產生很低的特異性吸附。它的機械強度高于葡聚糖，分離蛋白質的分子量范圍可達10^8。
瓊脂糖凝膠的不足之處是它不宜干燥和反復膨脹使用，若長期保存應添加無害的抑菌劑（0.2%疊氮鈉、甲苯），并在8℃以下不結冰的環(huán)境下保存，若冰凍會導至凝膠球的結構產生不可逆的破壞。
瓊脂糖凝膠的商品型號為Sepharose（Pharmacia，瑞典）和BioGelA（Bio-Rad，美國），近來使用2，3)二溴丙醇作交聯(lián)劑制得的SepharoseCL（Pharmacia，瑞典）可經受110-120℃高壓滅菌處理，在pH-3-4介質中使用，其穩(wěn)定性大大提高，可用含高濃度脲、鹽酸胍、有機溶劑和非離子型表面活性劑的流動相進行洗脫。常用的瓊脂糖商品性能及應用范圍見表6-2-3。最新報道的將瓊脂糖先與含多環(huán)氧基長鏈交聯(lián)劑（如聚乙二醇）進行交聯(lián)，然后再用短鏈交聯(lián)劑（如2，3-二溴丙醇）進行第二次交聯(lián)，可制得凝膠商品為Superose,，它的機械強度和化學穩(wěn)定性進一步提高，當用0.1mol/LHCL及0.1mol/LNOaoh在40℃處理14天后，色譜性能無明顯改變，并能承受70%甲酸及30%乙腈的處理，它可作為高效液相親和色譜的基體材料。
表6-2-3瓊脂糖商品性能及應用范圍(略）
�。�2）合成有機高聚物
在親和色譜中使用的合成有機高聚物，其表面應具有親水性，且粒度均勻，具有多孔或非多孔結構，可分為以下幾種類型的高聚物。
�、倬郾０芳捌溲苌锞郾０肥怯蓡误w丙烯酰胺、交聯(lián)劑N，N-亞甲基二丙烯酰胺，在引發(fā)劑N，N，N，N-四甲基乙二胺和過硫酸銨存在下聚合而成，它為具有網狀結構的凝膠，其制備反應如下：
常用商品型號為BioGelP（Bio-Rad，美）軟質球形凝膠，其中P表示交聯(lián)度，P值愈大表示交聯(lián)度高，其孔徑也愈大。它可在pH=2-10的介質中使用，有較好的化學穩(wěn)定性，其主要優(yōu)點是具有大量可修飾的酰胺官能團，可用多種方法進行偶聯(lián)反應；不足之處在于機械強度較差，網孔小，不宜用作生物大分子的分離。表6-2-4為Bio-GelP型商品的主要性能和應用范圍。
聚丙烯酰胺——瓊脂糖共聚物Utroggel（LKB/，瑞典）是一種新型聚合物，它具有聚丙烯酰胺的三維晶格，其空隙內又含有瓊脂糖凝膠，并具有可功能化的酰胺基和羥基，粒度為60-140μm，機械性能較強，比常用的凝膠基體耐壓，可在較高流速下操作，表6-2-5列出Utroggel的技術規(guī)格。
由N，N-亞甲基二丙烯酰胺與丙烯基葡聚糖共聚生成的Sephacryl（Phamarcia，瑞典）硬質凝膠，粒度25-75μm，可在pH=3-11介質中使用，于120℃、pH=7的環(huán)境中消毒。它用0.2mol/LNaOH室溫處理100h，凝膠的多孔性和流速無變化，并可用含6mol/L鹽酸胍和十二烷基磺酸鈉（SDS）的流動相進行洗脫，Sephacryl-2-6系列性質見表6。
以N-丙烯�；�-2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇為單體，以N，N-二乙烯基酒石酸二酰胺為交聯(lián)劑，聚合生產的Trisacryl（IBFBiotechnics,法）凝膠，具有良好的親水性、低的非特異性吸附，良好的機械性能和化學穩(wěn)定性，可在pH=1-11介質中使用，可耐受變性劑和有機溶劑，并具有抵抗微生物侵蝕能力，其骨架主鏈上的羥甲基官能團可用多種方法活化，它對配位體蛋白質的鍵合容量高于瓊脂糖基體，現已獲愈來愈廣泛的應用。
�、诩谆┧狨ス簿畚锞奂谆┧崃u乙酯是由單體甲基丙烯酸-2-羥基乙酯（HEMA）與交聯(lián)劑二甲基丙烯酸-1,2-亞乙基酯（EDMA）共聚生成的、具有剛性網狀結構的疏水球狀顆粒，粒徑10μm，有良好的機械強度和化學穩(wěn)定性，在pH=2-13介質中使用，可耐2mol/LHCL或NaOH清洗，加熱至170℃進行高壓滅菌而不分解，它富含羥基可用多種方法活化，可作為高效液相色譜固定相使用。另一種聚甲基丙烯酸縮水甘油酯是甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、季戊四醇二甲基丙烯酸酯（PDMA）和聚乙二醇（PEG）三者的共聚物，具有良好的機械強度和化學穩(wěn)定性，粒徑10μm，可在pH=2-12介質中使用，可耐受脲、鹽酸胍、有機溶劑的處理，此凝膠富含醇羥基和醚基，可用多種方法活化，常用于高效親和色譜的是TSKToyopear(ToyoSodaCorporation，日）HW-65F凝膠。
�、垭迦渲�1，2-丙二醇介質中，尿素與甲醛在硝酸鐵催化劑存在下，40℃行縮聚反應4h，可制得單分散非多孔微球，粒徑約2-4μm，可在pH=1-13介質中使用，顯示良好的機械強度和化學穩(wěn)定性，脲醛樹脂微球表面的酰胺基團可用多種方法活化，已作為高效親和色譜固定相的基體。
�、芨呓宦�(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物交聯(lián)度達40%-90%的苯乙烯——二乙烯基苯共聚制得的全多孔微球，粒度10-40μm，孔徑30-100nm，它是在80年代以后采用種子聚合法制成的新型基體材料，可在pH=1-14的介質中使用，具有良好的機械強度和化學穩(wěn)定性，可直接作為高效反相色譜固定相使用，其表面呈強疏水性，可經磺化或氯甲基化反應后，偶聯(lián)適當的間隔臂和配位體，并已在高效親和色譜中獲得愈來愈多的應用。
應當指出由高交聯(lián)苯乙-二乙烯基苯共聚物制得的灌注色譜固定相——POROS（PerSptiveBiosystems，美），開辟了對生物大分子分離的新途徑，它在10-20μm的球形顆粒上，制備出具有600-800nm的貫流大孔并與80-150nm的滲流小孔相溝通的特殊網絡結構，可在廣泛的x;值范圍、低柱壓下實現生物大分子的快速分離。此類填料經磺化或氯甲基化處理后，也可用于制取高效親和色譜固定相。
近年還研制出高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯非多孔共聚微球，其粒徑僅2-5μm，可裝填于φ4.6mmx5cm的短色譜柱中，也可實現生物大分子的快速分離。
�。�3）無機載體材料
現在高效液相色譜中廣泛采用的無機載體材料是Sio2，其中粒徑5-10μm、孔徑30-100nm的全多孔Sio2微球，在高效親和色譜中使用較多，近年為實現生物大分子的快速分離，也逐漸使用2-5μm非多孔Sio2微球。
80年代末期不少色譜工作者已探討使用機械強度高、在廣泛pH值范圍內穩(wěn)定的ZrO2、Tio2、CeO2和Wo3作為高效親和色譜的新型載體，并研制成功全多孔微球和非多孔微球的制造方法，已取得可喜的成果。
2.基體材料的活化——功能化反應和偶聯(lián)反應
前述各種基體材料皆需進行活化處理后，才能與間隔臂聯(lián)接，各種活化基體的方法如下：
�。�1）無機載體材料的活化
①活化方法以Sio2為代表的無機載體材料，經鹽酸處理后，其表面含大量硅羥基，此羥基可與活化試劑——硅烷偶聯(lián)劑反應，使基體功能化，而成為表面聯(lián)接有反應活性官能團的活化基體。如經鹽酸處理過的Sio2與γ-氨丙基三乙氧基硅烷進行的活化反應為：
表6-2-7常用硅烷偶聯(lián)劑(略）
�。�2）合成高聚物基體的活化對聚丙烯酰胺基體可用含雙官能團的活化試劑，如戊二醛、乙二胺、N-羥基丁二酰亞胺等來進行活化，活化反應如下：
對苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，常用氯甲基化反應、磺化反應、硝化反應進行活化，活化反應如下：
�。�3）多糖聚合物的活化
瓊脂糖、葡聚糖均含有大量羥基，可與含親電子基團的活化試劑，如溴化氰、環(huán)氧氯丙烷、二乙烯基砜、丁二酰氯等反應，進行活化，活化反應如下：
（二）間隔臂
在親和色譜固定相中，需通過間隔臂將配位體聯(lián)接在基體上，由于間隔臂占據一定的機動空間，當配位體與被測定的生物分子（尤其是生物大分子）產生親和作用時，有利于克服存在的空間阻礙作用。
當粒度小、孔徑小的基體聯(lián)接小分子配位體時，或當大分子配位體比較密集地分布在基體上時，其與被測定生物分子的親和作用，會受到空間阻礙作用的影響。為了克服空間阻礙作用，并實現配位體與被測定生物分子間最佳的相互作用，必須解決如下兩個主要問題。
1.間隔臂長度的選擇
關于間隔臂的長度，經過前人大量實踐經驗已經確定，對低親和能力的配位體或當作用物為生物大分子（蛋白質）時，在基體和配位體之間的間隔臂長度約為2-12個原子的距離。為獲得最佳的親和作用，它們之間需插入4-6個亞甲基的橋鍵。對具有高親和能力的配位體或當作用物為表觀分子量低的生物分子時，對間隔臂長度的要求就不如上述系統(tǒng)那樣嚴格。
2.用作間隔臂的化合物的選擇
對用作間隔臂的化合物，文獻上推薦使用具有NH2(CH2)nr通式的ω-氨烷基化合物。通式中R可為羧基、羥基、胺基或配位體自身。此類化合物分子中含n個亞甲基（—CH2—）疏水性基團。
具有疏水性基團的間隔臂分子會與配位體或作用物生物分子之間產生非特異性吸附作用，干擾配位體與生物分子間特效性的鎖匙相互作用，為消除非特異性吸附，可在沿間隔臂分子的長軸方向的某些原子上偶聯(lián)亞胺基（—NH2—）、羥基（—OH）等官能團，以破壞單一的疏水區(qū)域，增強親水性。
顯然，當使用親水性強的間隔臂分子來代替疏水性間隔臂分子時，會顯著降低對鎖匙特效親和作用的干擾。有些親和色譜分離實例還表明，當存在少量非特異性吸附現象時，親和色譜分離卻會得到最有價值的分析結果。因此在親和色譜分析中，仔細控制特效性親和作用和非特異性疏水作用的平衡，會比完全消除非特異性吸附作用更有利。
間隔臂分子長度的選擇，可依據前述慣例或依據制備的難易程度加以考慮，只要獲得最佳分離效果，就不必再增加臂長。間隔臂過長，會因撓性引起折疊或纏繞，也會使能與生物分子作用的配位體密度減小，并增加非特異性吸附或降低色譜柱柱效。
用作間隔臂的化合物結構，與活化基體時使用的活化試劑相似，皆為含有雙官能團的化合物，其分子一端與活化基體聯(lián)接，另一端將與配位體偶聯(lián)。
可作為疏水性間隔臂的有機化合物有：
作為親水性間隔臂的有機化合物有：小肽類如，由兩個甘氨酸和一個賴氨酸縮合的三肽，在實際使用中應根據親和色譜分離目的的不同而恰當的采用疏水性或親水性間隔臂。
�。ㄈ┡湮惑w
在親和色譜固定相上鍵聯(lián)的配位體，可為染料配位體、定位金屬離子配位體、包合配合物配位體、生物特效配位體、電荷轉移配位體和共價配位體，以下分別予以闡述。
染料配位體
三嗪活性染料為主要使用的染料配位體（DyeLigand），此類染料分子的結構與生物酶的天然底物相似，故可與酶或蛋白質的活性作用點結合而用于親和色譜。
氯原子被取代基依次置換后，其化學活性顯著下降。當反應溫度為0-5℃時，第一個氯原子可被置換；當反應溫度為40-50℃時，第二個氯原子可被置換；第三個氯原子需加熱90℃以上才可被置換。
三嗪活性染料產品主要為瑞士汽巴8嘉基公司（Ciba-Geigy）生產的$-9/;<=0系列和英國帝國化學工業(yè)公司（ICI）生產的Procion系列。它們可分為三種不同類型的產品，即二氯三嗪型、一氯三嗪型和一氟三嗪型。
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