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抑菌實(shí)驗(yàn)
于測(cè)定抗菌藥物體外抑制細(xì)菌生長(zhǎng)效力的試驗(yàn)稱為抑菌試驗(yàn)。通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)，可以測(cè)定一個(gè)藥物的最低抑菌濃度，用以評(píng)價(jià)該藥物的抑菌性能，這是抗菌藥物的最基本的藥效學(xué)數(shù)據(jù)。主要方法有進(jìn)行定性測(cè)定的擴(kuò)散法（如抑菌斑試驗(yàn)）和進(jìn)行定量測(cè)定的稀釋法（如最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)）。[1]
1簡(jiǎn)介
2常用方法
? 常量肉湯稀釋法
? 微量肉湯稀釋法
? 瓊脂稀釋法
? 紙片擴(kuò)散法
? E試驗(yàn)
簡(jiǎn)介編輯 用于測(cè)定抗菌藥物體外抑制細(xì)菌生長(zhǎng)效力的試驗(yàn)稱為抑菌試驗(yàn)。通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)，可以測(cè)定一個(gè)藥物的最低抑菌濃度，用以評(píng)價(jià)該藥物的抑菌性能，這是抗菌藥物的最基本的藥效學(xué)數(shù)據(jù)。主要方法有進(jìn)行定性測(cè)定的擴(kuò)散法（如抑菌斑試驗(yàn)）和進(jìn)行定量測(cè)定的稀釋法（如最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)）。[1]
常用方法編輯 常量肉湯稀釋法
A、抗菌藥物貯存液制備
1.1.1.抗菌藥物貯存液制備 抗菌藥物貯存液濃度不應(yīng)低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高測(cè)定濃度。溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度。抗菌藥物直接購(gòu)自廠商或相關(guān)機(jī)構(gòu)。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進(jìn)行計(jì)算。例如：需配制100 ml濃度為1280μg/ml的抗生素貯存液，所用抗生素為粉劑，其藥物的有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為182.6 mg。根據(jù)公式計(jì)算所需稀釋劑用量為：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后將182.6 mg抗生素粉劑溶解于107.0ml稀釋劑中。制備抗菌藥物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見(jiàn)表5。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于
-60℃以下環(huán)境，保存期不超過(guò)6個(gè)月。
B、藥敏試驗(yàn)用抗菌藥物濃度范圍
1.1.2.藥敏試驗(yàn)用抗菌藥物濃度范圍 根據(jù)NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點(diǎn)值，特殊情況例外。
C、培養(yǎng)基
1.1.3. 培養(yǎng)基 NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。在測(cè)試葡萄球菌對(duì)苯唑西林的敏感性時(shí)，應(yīng)在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉，按制造廠家的要求配制需要量的MH肉湯。嗜血桿菌屬菌使用HTM肉湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含2%~5%溶解馬血的MH肉湯。
D、接種物的制備
1.1.4.接種物的制備 有2種方法配制接種物，一是細(xì)菌生長(zhǎng)方法，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落3-5個(gè)，接種于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35℃孵育2-6h。增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落懸液配制法，對(duì)某些苛養(yǎng)菌，如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐藥的葡萄球菌等菌株，推薦直接取培養(yǎng)18~24h的菌落調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶100稀釋后備用。注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。
注：在臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)中，麥?zhǔn)媳葷岱ǔＳ糜诩?xì)菌鑒定、藥敏實(shí)驗(yàn)前配置菌液時(shí)大致判斷菌液濃度的一種方法，通常認(rèn)為，如將配菌液濃度配成0.5麥?zhǔn)媳葷峁軙r(shí)，相當(dāng)于
1.5×108細(xì)菌數(shù)/ml，由于方法本身就是一種估計(jì)的方法，所以盡管不同細(xì)菌大小差異很大，除了真菌孢子，細(xì)菌的差別不大，結(jié)果不會(huì)有影響。但是，標(biāo)準(zhǔn)比濁管的濃度，是藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響因素之一。
E、附：0.5麥?zhǔn)媳葷峁芘渲品椒?/p>
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。
有效期為6個(gè)月。
F、稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種
1.1.5.稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種 取無(wú)菌試管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入抗菌藥物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混勻，然后吸取1ml至第2管，混勻后再吸取1ml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。此時(shí)各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。
G、孵育
1.1.6.孵育 將接種好的稀釋管塞好塞子，置35℃普通空氣孵箱中孵育16~20h；嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育20~24h；對(duì)可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬(wàn)古霉素腸球菌應(yīng)持續(xù)孵育滿24h。
H、結(jié)果判斷與解釋
1.1.7.結(jié)果判斷與解釋 在讀取和報(bào)告所測(cè)試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長(zhǎng)對(duì)照管的細(xì)菌生長(zhǎng)情況是否良好，同時(shí)還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為受試菌的MIC。甲氧芐胺嘧啶或磺胺藥物的肉湯稀釋法終點(diǎn)判斷，與陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照管比較抑制80%細(xì)菌生長(zhǎng)管藥物濃度為受試菌MIC。
根據(jù)NCCLS推薦的分界點(diǎn)值標(biāo)準(zhǔn)，判斷耐藥（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被測(cè)菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效，禁忌癥除外。R指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內(nèi)或血液中所達(dá)到的濃度所抑制，或?qū)儆诰哂刑囟退帣C(jī)理（如β-內(nèi)酰胺酶），所以臨床治療效果不佳。I是指MIC接近藥物的血液或組織液濃度，療效低于敏感菌。還表示被測(cè)菌株可以通過(guò)提高劑量（如β-內(nèi)酰胺類藥物）被抑制，或在藥物生理性濃集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介還作為“緩沖域”，以防止由微小的技術(shù)因素失控，所導(dǎo)致較大的錯(cuò)誤解釋。
微量肉湯稀釋法
A、抗菌藥物和培養(yǎng)基制備
1.2.1.抗菌藥物和培養(yǎng)基制備 同常量肉湯稀釋法。
B、MIC板制備
1.2.2.MIC板制備 無(wú)菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10μl，第12孔不加藥作為生長(zhǎng)對(duì)照，冰凍
干燥后密封，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>
C、接種物制備
1.2.3.接種物制備 將用生長(zhǎng)法或直接菌懸液法制備的濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1∶1000稀釋后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空氣孵箱中，孵育16~20h判斷結(jié)果。當(dāng)試驗(yàn)嗜血桿菌屬，鏈球菌屬時(shí)，孵育時(shí)間為20~24h，試驗(yàn)葡萄球菌和腸球菌對(duì)苯唑西林和萬(wàn)古霉素的藥敏試驗(yàn)時(shí)孵育時(shí)間必須滿24h。此時(shí)，第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
D、結(jié)果判斷
1.2.4.結(jié)果判斷 以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔（即不含抗生素）內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)試驗(yàn)才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度。如出現(xiàn)多處跳孔，則不應(yīng)報(bào)告結(jié)果，需重復(fù)試驗(yàn)。通常對(duì)革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯稀釋法測(cè)得的MIC與常量肉湯稀釋法測(cè)得的結(jié)果相同或低一個(gè)稀釋度（1孔或2倍）。
瓊脂稀釋法
http://www.shangyepx.com/news/55A37683B340E31A.html A、介紹瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。本法優(yōu)點(diǎn)是可在一個(gè)平板上同時(shí)作多株菌MIC測(cè)定，結(jié)果可靠，易發(fā)現(xiàn)污染菌；缺點(diǎn)是制備含藥瓊脂平板費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
B、培養(yǎng)基制備
2.1.培養(yǎng)基制備 使用MH瓊脂，按商品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎(chǔ)加1%添加劑；其它鏈球菌使用含5%（V/V）綿羊血的MH瓊脂（當(dāng)試驗(yàn)磺胺藥時(shí)，使用溶解的馬血）。
C、含藥瓊脂平板制備
2.2.含藥瓊脂平板制備 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制藥物瓊脂平板，根據(jù)需要來(lái)選擇藥物濃度范圍。配制好的含藥瓊脂平板應(yīng)裝入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可貯存5天。
D、接種物制備與接種
2.3.接種物制備與接種 制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的菌懸液，再1∶10稀釋，以多點(diǎn)接種器吸取制備好菌液（約1~2μl）接種于瓊脂平板表面，每點(diǎn)菌數(shù)約為104CFU，形成直徑為5~8mm的菌斑。接種好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐藥葡萄球菌、萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌孵育時(shí)間應(yīng)滿24h），觀察結(jié)果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細(xì)菌置5%二氧化碳、幽門(mén)螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。
E、結(jié)果判斷
2.4.結(jié)果判斷 將平板置于暗色、無(wú)反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。在含甲氧芐胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見(jiàn)輕微細(xì)菌生長(zhǎng)，與生長(zhǎng)對(duì)照比較抑制80%以上細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為終點(diǎn)濃度。
如果出現(xiàn)有2個(gè)以上菌落生長(zhǎng)于含藥濃度高于終點(diǎn)水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長(zhǎng)而高濃度藥物瓊脂平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗(yàn)。 紙片擴(kuò)散法
紙片擴(kuò)散法(K-B法)又稱瓊脂擴(kuò)散法
K-B法藥敏試驗(yàn)時(shí)接種物配制有兩種方法。
第一種是肉湯增菌法（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)法），是用接環(huán)挑取3-5個(gè)細(xì)菌菌落入肉湯增菌管中進(jìn)行增菌4-6小時(shí)，然后用生理鹽水或肉湯對(duì)增菌管中的培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋校正使其濃度達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（因?yàn)榻?jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)其培養(yǎng)物濃度一般都高于此標(biāo)準(zhǔn)）。
第二種方法是直接菌落法：從孵育18-24小時(shí)的非選擇性培養(yǎng)基上，挑取3-5菌落，直接用肉湯或鹽制成懸液作為接種，然后將濁度調(diào)整至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)。此法是檢測(cè)苛養(yǎng)菌（如嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌）和潛在的對(duì)甲氧西林耐藥的葡萄球菌的推薦方法。
將菌制成菌懸液用無(wú)菌棉簽蘸取菌液在管壁上擠去多余菌液 ,涂布整個(gè)M2H平板表面 ,反復(fù) 3 次 ,每次將平板旋轉(zhuǎn)60 度 ,保證涂布均勻 ,35 ℃培養(yǎng)后菌落呈半融合狀態(tài) ,否則影響藥敏結(jié)果。
K-B 法指定用 M-H瓊脂平板 ,應(yīng)用直徑90cm平皿 ,在水平的無(wú)菌臺(tái)上傾倒 ,準(zhǔn)確量取高壓滅菌后的M2H瓊脂液25ml ,使之瓊脂板厚度為 4mm。否則厚度過(guò)高 ,使含藥物紙片的藥物半球形擴(kuò)散的體積加大 ,導(dǎo)致假耐藥;反之導(dǎo)致假敏感。
要求紙片直徑 6.00～6.35mm每片吸水量約012 μl ,紙片的藥物含量必須與 K 2B 法
規(guī)定的
一致 ,用前必須做質(zhì)量鑒定 ,質(zhì)量合格方可使用。紙片的保存尤為重要 ,一般要求保存在有干燥劑的容器內(nèi)低溫保存 ,紙片取出后須放室溫10min后方可打開(kāi) ,否則空氣中的水份冷凝在紙片上易潮解 ,使藥物失效影響藥敏試驗(yàn)結(jié)果。
E試驗(yàn)
E試驗(yàn)是指濃度梯度瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，其原理基本同擴(kuò)散法，即濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料試條中向瓊脂中擴(kuò)散，在試條周圍抑菌濃度范圍內(nèi)受試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈。E試驗(yàn)綜合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)，同時(shí)還彌補(bǔ)了二者的一些不足，可以像稀釋法一樣直接定量測(cè)出抗菌藥物對(duì)受試菌的MIC。
A、培養(yǎng)基、菌液制備和接種
3.1.培養(yǎng)基、菌液制備和接種 同紙片擴(kuò)散法。
B、貼E試驗(yàn)條
3.2.貼E試驗(yàn)條 同紙片擴(kuò)散法，E試驗(yàn)條的刻度面朝上，不得貼反，一旦接觸瓊脂后不得再移動(dòng)。直徑150mm的平皿內(nèi)可放置6根E試驗(yàn)試條，90mm者一般只能放置1根。
C、孵育時(shí)間和溫度
3.3.孵育時(shí)間和溫度 同紙片擴(kuò)散法。
D、結(jié)果閱讀
3.4.結(jié)果閱讀 孵育后圍繞試條可形成一個(gè)橢圓形的抑菌圈，在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數(shù)刻度即是測(cè)定抗菌藥物對(duì)受試菌的MIC。閱讀時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題見(jiàn)供應(yīng)商的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。
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